实时荧光定量PCR（qPCR）彻底改变了科学家检测和定量核酸靶标的方式，具有高灵敏度、速度快、可扩展性强等优势。许多实时PCR实验在每个反应孔中只检测一个靶标，这种方式称为单重qPCR（Singleplex qPCR）。
然而，通过一种称为多重qPCR（Multiplex qPCR）的方法，可以进一步提升实时PCR的效率。多重qPCR允许在同一个反应孔中同时扩增并检测多个相互独立的靶标，从而在更少的反应次数中获得更多数据，同时提高试剂利用率并改善实验重复性。
无论是进行基因表达分析还是病原体检测，多重qPCR都能有效简化实验流程。从单重到多重：工作原理。
一个典型的实时PCR实验通常包含：一对引物
在使用染料法或TaqMan™探针法时，还包括一个带有荧光标记的探针，在单重 qPCR实验中，每个反应孔只扩增一个检测项目。
在多重qPCR中，则可在同一个反应孔中同时扩增两个或多个靶标，每个靶标通过带有不同荧光染料的探针进行区分。
在现有的化学体系中，TaqMan探针法非常适合多重qPCR，因为：探针本身具有高度特异性，每个探针对应独立的荧光信号。
这种“双重优势”使研究人员能够在一次反应中扩增多个检测项目，并分别对每个靶标进行准确检测。
为什么选择多重 qPCR？
与单重qPCR相比，多重qPCR具有显著优势：更高的通量，每孔检测更多靶标，提高整块反应板的检测效率，更低的试剂和样本消耗，更高效地利用昂贵试剂和有限的生物样本。
更高的精密度与可靠性，同孔内的内参对实验波动进行归一化更高的数据可信度，与单重qPCR不同，所有靶标和内控在同一反应孔中完成，更具可比性通常，从双重qPCR（Duplex）开始是一个现实可行的第一步。随着技术发展，通过在单个反应中结合3个或更多靶标，多重qPCR的优势将进一步放大。在Thermo Fisher Scientific提供的先进工具、服务和产品支持下，高阶多重qPCR（最多6个靶标）已不再遥不可及。
什么时候最适合使用多重qPCR？
在以下情况下，多重qPCR的价值尤为突出：需要对大量样本使用相同的一组检测项目。
对数据质量和质量控制要求较高，样本量有限或样本十分珍贵，如果你的项目需要检测的靶标数量很多（例如超过12个），那么使用实时PCR芯片阵列（qPCR Array）可能会更加高效。
随着多重反应中靶标数量增加（3–6 个），实验设计的复杂性也会显著提升。此时，一些技术应用科学家（TAS）和现场应用科学家（FAS）可提供专业指导。
如何设计一个成功的多重qPCR实验？
成功的多重qPCR流程需要合理的实验设计与充分的测试，主要包括以下几个方面：
选择兼容的检测项目，首先确定你希望组合的检测项目。可实现的多重数量取决于仪器的光学检测通道数。例如：如果仪器具备6个检测通道，理论上最多可同时检测 6个靶标。
可使用qPCR Assay Design Hub中的 Multiplexing Support Request Tool 检查检测项目的兼容性。多重支持团队还可提供免费的计算机模拟分析，以识别潜在的引物或探针相互干扰问题。
选择合适的荧光染料
合理的染料选择有助于实现清晰的光谱区分。
推荐使用的染料包括：FAM、VIC ROX、Cy5、Cy5.5、CY3大多数Applied Biosystems™试剂都包含被动参比染料 ROX™，在多重qPCR中尤为有益。
柏恒科技Q9600系列无需ROX通道可进行多重实验可自由选择相应的染料，无需要进行染料校准。
引物浓度优
在单重TaqMan实验中，通常推荐使用统一的引物浓度（900 nM）。
但在多重反应中，如果仍使用该浓度，可能会导致：高丰度靶标迅速扩增。
Taq DNA聚合酶被“耗尽”或饱和抑制低丰度靶标的扩增为避免这种情况，可对某些检测项目采用降低引物浓度的策略。
研究人员应根据各靶标的预期丰度，决定哪些检测项目需要进行引物限制。原理说明：
普通条件下，高丰度靶标扩增至聚合酶饱和后进入线性期低丰度靶标也被迫进入线性期，Ct值不准确甚至无法检测，通过引物限制，使扩增因引物耗尽而非聚合酶饱和进入线性期，从而保证低丰度靶标仍处于指数扩增阶段 提供：VIC标记、引物限制（PL）格式的基因表达检测，定制 TaqMan™基因表达检测特殊寡核苷酸合成服务，可选择不同染料与PL格式，放大规模前的性能测试在正式应用多重qPCR 之前，必须对其性能进行验证。
更严格的方法：混合标准曲线将一个靶标进行系列梯度稀释同时加入固定量的第二个靶标。在实时PCR中扩增混合样本。理想情况下，两个靶标在整个检测范围内都应保持良好的线性关系对于三重或更高阶多重反应，需要测试多组靶标组合。
较简化的方法：对同一批样本分别进行单重和多重扩增比较两种结果的一致性将多重检测整合为单管试剂，如果多重qPCR 的性能验证结果令人满意，可使用特殊寡核苷酸将所有检测项目预混为单管形式。
其优势包括：简化实验配制流程，确保引物和探针比例一致，提高实验重复性。
